دوره آموزشی تکنیک های کشت سلولی

کشت سلولی به فرآیند کشت یوکاریوتی در یک محیط کشت گفته می‌شود که شرایط کشت برای هر نوع سلول متفاوت بوده و باید برای رشد بهتر آن این شرایط مهیا شود؛ اما به طور کلی می توان گفت که محیط های مصنوعی باید حاوی مواد مغذی مانند ویتامین ها، مواد معدنی، قندها، آمینو اسیدها، هورمون ها و گازها باشد.مطلب زیر برای افرادی است که می خواهند در حوزه رشته های آزمایشگاهی و تحقیقاتی وارد بازار کار شوند و مهارت های مورد نیاز را بیاموزند.

تکنیک های کشت سلولی

كشت سلولي تكنيكي است كه عمدتاً بصورت واحد نظـري و عملـي پيشـنياز و يـا اصـلي دربرخي مقاطع فوق ليسانس يا دكترا گنجانده شده است. برگزاري بخش عملي ايـن درس نيـاز به تجهيزات خاص و امكان ورود دسته جمعي دانشجويان به اتاق كشت دارد در نتيجه گـروه هاي آموزشي معمولاً در ارائه چنين درسي براي دانشجويان بـا مشـكل واجـه هسـتند. كمتـر آزمايشگاه تحقيقاتي بيولوژي، ايمونولوژي، بيوشيمي، ژنتيك و مشابه آن وجود دارد كه از ايـن تكنيك به عنوان يك ابزار مفيد استفاده نكند.

لذا محققين و كارشناساني كه براي اولين بـار بـا اتاق كشت سلولي مواجه مي شوند متوجه مي شوند كه بدون كسب تجربه، كار كردن در اتاق كشت بي معني است. از آنجايي كه لوازم و سلول هاي موجود در اين محيط بسـيار بـا ارزش بوده و كوچكترين خطايي ممكن است زيان هاي جبران ناپذيري ايجاد كند، كاربران در ابتداي كار با مشكلات زيادي نظير عدم دسترسي به دستورالعمل ها و روش هاي كار مواجه هستند.

محیط‌های کشت اختصاصی برای رشد سلول‌های مشخص نیز وجود دارد. مانند محیط کشتی که در آن فقط هپاتوسیت‌ها رشد می‌کنند و یا محیط کشت‌هایی که فقط نورون‌ها که تقسیم نمی‌شوند، می‌توانند زنده بمانند. برای اینکه سلول‌ها در محیط کشت بخوبی تکثیر یابند، لازم است تراکم آن ها در محیط کشت کم باشد. برای این منظور باید هر چند وقت یکبار، سلول‌ها را به محیط کشت‌های تازه پاساژ داد. در صورتیکه تراکم سلول‌ها بالا رود، بعلت ممانعت تماسی تکثیر سلول‌ها متوقف شده و سلول‌ها وارد مرحله تمایز می‌شوند که یکی از مراحل کشت سلولی است .

یکی از اهداف کشت سلولی مطالعه سلول ها از نظر نحوه رشد، نیازهای غذایی و علل توقف رشد آنهاست که تغییرات هر کدام می تواند بر مورفولوژی این سلول ها که ما در زیر میکروسکوپ مشاهده می کنیم، تاثیر زیادی داشته باشد. بنابراین برای مطالعه چرخه رشد سلولی، توسعه روش های کنترل رشد سلول های سرطانی و تعدیل بیان ژن ها نیاز به کشت این سلول ها در محیط خارج بدن می باشد.

تاریخچه کشت سلول

فیزیولوژیست انگلیسی قرن نوزدهم ، سیدنی رینجر ، محلول های نمکی حاوی کلریدهای سدیم ، پتاسیم ، کلسیم و منیزیم مناسب برای حفظ ضربان یک قلب جانوری جدا شده در خارج از بدن را ایجاد کرد. در سال 1885 ، ویلهلم روکس بخشی از صفحه مدولاری یک مرغ جنینی را برداشته و آن را برای مدت چند روز در یک محلول نمکی گرم نگه داشت و  کشت بافت را بنیاگذاری کرد. راس گرانویل هریسون ، که در دانشکده پزشکی جانس هاپکینز و سپس در دانشگاه ییل فعالیت می کرد ، نتایج آزمایش های خود را از سال 1907 تا 1910 منتشر کرد و روش های کشت بافت را تعیین کرد.

مفاهیم در کشت سلولی

☑️جداسازی سلول ها

سلول ها برای کشت آزمایشگاهی از چندین روش می توانند از بافت جدا شوند. سلول ها را می توان به راحتی از خون خالص کرد. با این حال ، فقط سلولهای گلبول سفید قادر به رشد در بستر هستند.

سلول ها را می توان با هضم ماتریس خارج سلولی با استفاده از آنزیم هایی از جمله کلاژناز ، تریپسین یا پیروناز ، از بافت جامد جدا کرد و قبل از همزده شدن بافت ، سلول ها را به حالت شناور درآورد. از طرف دیگر ، تکه های بافت را می توان در محیط رشد قرار داد و سلولهایی که رشد می کنند برای کشت در دسترس هستند. این روش به عنوان کشت اکتشافی شناخته می شود.

سلولهایی که مستقیماً از یک موضوع کشت می شوند به عنوان سلولهای اصلی شناخته می شوند. به استثنای برخی از تومورها ، اکثر کشتهای سلولی اولیه طول عمر کمی دارند.

☑️حفظ سلول در کشت

برای اکثر سلولهای اصلی جدا شده ، که روند پیری را پشت سر می گذارند و بعد از اینکه تعداد مشخصی از جمعیت دو برابر شد ، تقسیم می شوند و در عین حال بقای خود را حفظ می کنند (به عنوان حد هایفلیک توصیف می شود).

☑️شرایط مناسب کشت سلول

سلول ها در دمای مناسب و مخلوط گاز (بطور معمول 37 درجه سانتیگراد ، 5٪ CO2 برای سلول های پستانداران) در انکوباتور سلول رشد و نگهداری می شوند. شرایط کشت برای هر نوع سلول بسیار متفاوت است و تغییر شرایط برای یک نوع سلول خاص می تواند منجر به فنوتیپ های مختلف شود.

گذشته از مخلوط دما و گاز ، مهمترین عامل در سیستم های کشت ، محیط رشد سلول است. دستور العمل های مربوط به محیط رشد می تواند در pH ، غلظت گلوکز ، فاکتورهای رشد و همچنین وجود سایر مواد مغذی متفاوت باشد. فاکتورهای رشدی که برای تکمیل رسانه استفاده می شوند ، غالباً از سرم خون حیوانات ، مانند سرم گاوی جنین (FBS) ، سرم گوساله گاو ، سرم اسب گاوی و سرم خوک حاصل می شود.

☑️عوارض استفاده از سرم های جانوری

یکی از عوارض این ترکیبات مشتق از خون ، احتمال آلودگی آن ها به ویروس یا ویروس ها به خصوص در کاربردهای بیوتکنولوژی پزشکی است. روش فعلی این است که در هر کجا امکان دارد استفاده از این مواد را به حداقل رسانده یا از بین ببرید و از لیزات پلاکت انسانی استفاده کنید.

انواع کشت سلول

☑️کشت ارگان

در این نوع کشت، بافت در سطح تماس مایع – گاز قرار می‌گیرد که در آن ساختار سه بعدی بافت حفظ خواهد شد.

☑️کشت اولیه قطعات بافتی

در این روش بخشی از بافت در سطح جامد قرار می‌گیرد و با محیط مایع در تماس است که در آن  به منظور رشد، سلول‌ها مهاجرت می‌کنند.

☑️کشت سلول

در این روش پس از لیز بافت به روش مکانیکی یا آنزیمی، سلول‌های حاصل به صورت یک لایه چسبنده روی یک سوبسترا یا سوسپانسیون سلولی کشت داده می‌شود

نکات مهم در کشت سلول

✅قبل از شروع کار از سالم بودن هود اطمینان حاصل کنید.

✅هود مورد استفاده در اتاق کشت هود لامینار کلاس II میباشد  که دارای فیلترهای  HEPA هستند.

✅زیر هود و سطوح تمام وسایلی که باید زیر هود آورده شود، از قبل با الکل ۷۰% ضدعفونی میشوند.

✅وسایل زیر هود به ترتیب از چپ به راست از  وسایل استریل به سمت waste چیده می شوند.

✅بهتر است قبل از شروع به کار چک لیستی از کارهایی که باید انجام بدهید(ضدعونی کردن سطوح، استریل کردن وسایل، اطمینان از  تمیزی روپوش، روشن کردن لامپ UV و ....) تهیه کنیم تا از انجام آنها اطمینان داشته باشیم.

✅پاساژ دادن یا تهیه subculture به معنی انتقال سلول های در حال تکثیر به فلاسک حاوی محیط جدید است.

✅میزان سلول و حجم مناسب با توجه به فلاسک  و پلیت های مختلف در جدول زیر به نمایش در امده است:

✅کلمه Confluence به معنی درصد پرشدن فضای فلاسک یا پلیت کشت است وقتی Confluence  به ۷۰ الی ۸۰% رسید سلولها باید پاساژ داده شوند.
✅زمان مناسب برای پاساژ دادن سلول ها هنگامی است که سلول ها در مرحله log نمودار رشد خود باشند؛ به عبارت دیگر قبل از  ایجاد clump  وکدورت محیط.
✅آلودگی باکتریایی  به راحتی با چشم غیر مسلح نیز قابل تشخیص هستند: محیط کشت ظاهر ابری (cloudy) به خود میگیرند. و pH محیط  نیز به طور ناگهانی کاهش پیدا میکند(زرد رنگ).

ویژگی های آزمایشگاه کشت سلولی

با توجه به اهمیت کشت سلولی باید توجه زیادی به موقعیت آزمایشگاه کشت سلولی شود؛ به عنوان مثال این آزمایشگاه به هیچ عنوان نباید در بخش های میکروب شناسی و یا محل نگهداری حیوانات قرار بگیرد. قرار گرفتن آزمایشگاه کشت سلول در مکان های پرتردد نیز کاملاً غلط است، زیرا این فرآیند بسیار حساس بوده و نیاز به توجه زیادی دارد. توجه داشته باشید که در این آزمایشگاه ها بهتر است از کابینت ها و میزهای استیل استفاده شده تا به راحتی بتوان هر چند مدت یک بار آن ها را ضدعفونی کرد. اتاقکی به عنوان اتاق قرنطینه نیز باید در آزمایشگاه تعبیه شود تا برای بررسی موارد تازه وارد از آن استفاده شود. درب آزمایشگاه نیز باید به صورت همیشگی بسته بوده و سطح دیواره های آزمایشگاه باید صاف و صیقلی باشد و با رنگ روشنی رنگ آمیزی شده و به صورت ضد آب باشد تا بتوان به راحتی آن را تمیز کرد.

محیط مناسب برای کشت سلولی

با توجه به اهمیت کشت سلولی در هنگام انجام این فرآیند باید محیط کار کاملاً استریل و بهداشتی باشد. لازم است که برای کشت سلولی تا حد امکان از اتاق جداگانه ای استفاده شده به طوری که این اتاق عاری از هرگونه شلوغی باشد؛ همچنین بهتر است که از یک تهویه ی هوا در اتاق استفاده شود. در نزدیکی آزمایشگاه کشت سلولی نباید بافت اولیه حیوانی کشت شود، بلکه باید یک آزمایشگاه جداگانه برای کشت سلولی به صورت استریل اختصاص داده شود. در ورودی آزمایشگاه باید از لباس ها و پوشش های مخصوص آزمایشگاه کشت سلول استفاده گردد. همچنین اگر نیاز به استفاده از ماده شیمیایی خطرناک در آزمایشگاه باشد، باید از هودهای عمودی استفاده گردد.

کاربردهای کشت سلول

❓شايد از خود سؤال كنيم كه چرا سلول ها را كشت مي دهيم؟

يكي از اهداف كشت سلولي مطالعه سلول ها از نظر نحوه رشد، نيازهاي غذايي و علـل توقـف رشد آنهاست. بنابراين براي مطالعه چرخه رشد سلولي، توسعه روش هاي كنترل رشد سـلول هاي سرطاني و تعديل بيان ژنها نياز به كشت اين سلول ها در محيط خارج بـدن مـي باشـد. يكي ديگر از كاربردهاي كشت سلولي، مطالعة تكامل جانداران است. اينكه چگونه يك سـلول لقاح يافته مي تواند به جانداري پرسلولي تبديل شود كه هـر يـك از سـلول هـاي آن از نظـر مورفولوژي و خصوصيات ديگر با هم متفاوت باشند. براي پاسخ به اين سـؤال مـي تـوان ايـن سلول لقاح يافته را در محيط آزمايشگاهي كشت داد و مراحل مختلف تكامـل و تمـايز آن را بررسي نمود. با كمك كشت سلولي مي توان سلول هايي تهيه نمـود كـه در مراحـل مختلـف تمايز قرار دارند و به كمك هورمون ها و فاكتورهاي رشد مي توانند به سـلول هـاي ديگـري متمايز شوند. انجام بعضي از مطالعات ژنتيكي از جمله توليد حيوانات ترانس ژنيكي كه بتوانند ژنهاي خاصي را بيان كنند فقط با كمك تكنيك كشـت سـلولي امكـان پـذير اسـت

سلول های بنیادی

کشت سلولهای بنیادی انسان برای گسترش تعداد سلولها و تمایز سلولها در انواع سلولهای سوماتیک جهت پیوند استفاده می شود. همچنین از کشت سلولهای بنیادی برای برداشت مولکولها و اگزوزومهایی که سلولهای بنیادی آزاد می شوند به منظور توسعه درمانی استفاده می شود.

محصولات بیوتکنولوژی با استفاده از DNA نوترکیب

محصولات بیولوژیکی تولید شده توسط فن آوری DNA نوترکیب (rDNA) در کشت سلولی حیوانات شامل آنزیم ها ، هورمون های مصنوعی ، سیستم ایمنی بدن (آنتی بادی های مونوکلونال ، اینترلوکین ها ، لنفوکین ها) و ضد سرطان است. اگرچه بسیاری از پروتئین های ساده با استفاده از rDNA در کشت باکتری قابل تولید هستند ، اما پروتئین های پیچیده تری که گلیکوزیله می شوند (با کربوهیدرات اصلاح شده) در حال حاضر باید در سلول های حیوانی ساخته شوند.

یک نمونه مهم از چنین پروتئین پیچیده هورمون اریتروپویتین است. هزینه رشد کشت سلولی پستانداران زیاد است ، بنابراین تحقیقات برای تولید چنین پروتئین های پیچیده در سلول های حشرات یا گیاهان بالاتر در حال انجام است ، استفاده از سلول جنینی تک و جنین های سوماتیک به عنوان منبع انتقال مستقیم ژن از طریق بمباران ذرات ، بیان ژن ترانزیت و مشاهده میکروسکوپ کانفوکال یکی از کاربردهای آن است. همچنین این امکان را می دهد تا منشا تک سلولی جنین های سوماتیک و عدم تقارن تقسیم سلولی اول را تأیید کند ، که این روند را آغاز می کند.

کشاورزی سلولی

کشت سلولی همچنین یک تکنیک کلیدی برای کشاورزی سلولی است که هدف آن ارائه هم محصولات جدید و هم روشهای جدید تولید محصولات کشاورزی موجود مانند شیر ، (گوشت کشت شده) ، رایحه ها و شاخ کرگدن از سلول ها و میکروارگانیسم ها است. بنابراین یکی از ابزارهای دستیابی به کشاورزی بدون حیوان محسوب می شود. همچنین یک ابزار اصلی برای آموزش زیست شناسی سلولی است.

واکسن ها

کشت انبوه رده های سلولی حیوانات برای ساخت واکسن های ویروسی و سایر محصولات بیوتکنولوژی اساسی است.

واکسن های فلج اطفال ، سرخک ، اوریون ، سرخچه و آبله مرغان در حال حاضر در کشت سلولی ساخته می شوند. با توجه به تهدید همه گیر H5N1 ، تحقیقات در مورد استفاده از کشت سلولی برای واکسن های آنفلوانزا توسط دولت ایالات متحده تأمین می شود. ایده های جدید در این زمینه شامل واکسن های نوترکیب مبتنی بر DNA است ، مانند موردی که با استفاده از آدنوویروس انسانی (ویروس سرماخوردگی) به عنوان یک وکتور  و ترکیبات جدید ساخته شده است.

کشت سلولی چه فایده ای دارد؟

كشت سلولي در مقايسه با استفاده از حيوانات آزمايشگاهي محاسن زيادي دارد. ايـن تكنيـك باعث توليد مقادير متنابهي سلول همسان و يك دسـت جهـت انجـام پـروژه هـاي تحقيقـاتي بيولوژي، پزشكي و غيره مي گردد. در صورت لزوم مي توان سلول هاي توليـد شـده را بـراي كاربردهاي مختلف پزشكي نظير مهندسي بافت و توليد بافت هـاي سـه بعـدي، ژن درمـاني، مي توان سلول هـاي كشـت 3 الكتروپوريشن و غيره بكار برد. از طرفي در محيط آزمايشگاهي داده شده را تحت تأثير داروها، مواد شيميايي، نور ماوراء بنفش و غيره قـرار داد و در نهايـت تغييرات ژنتيكي و بيوشيميايي را در ايـن سـلول هـا بررسـي نمـود، در حاليكـه انجـام چنـين از نظر اخلاق پزشكي مورد پذيرش نبوده و قابل اجـرا نيسـت. 4 آزمايشاتي در موجودات زنده بعلاوه استفاده از كشت سلولي نسبت بـه نگهـداري حيوانـات آزمايشـگاهي و كـار روي ايـن حيوانات هزينه بسيار كمتـري دارد. همچنـين از كشـتن بـي خـودي حيوانـات آزمايشـگاهي جلوگيري مي شود و از طرفي ايرادات قانوني و نياز به اخذ مجـوز جهـت كـار روي حيوانـات آزمايشگاهي ندارد. بطور كلي استفاده از سلول هاي كشـت داده شـده نسـبت بـه اسـتفاده از حيوانات آزمايشگاهي احترام به قوانين و اصول اخلاق پزشكي محسوب مي شود.

حوزه های مورد نیاز کشت سلولی

امروزه با پیشرفت های حاصل شده در زمینه علوم زیستی، امکان کشت و نگهداری بسیاری از سلول های جدا شده از بافت های جانوران در محیط آزمایشگاه فراهم آمده است. لذا کاربردهای تکنولوژی کشت سلول و بافت، طیف وسیعی از مطالعات سلولی و مولکولی زیست شناسان تکوینی و ژنتیک دانان، تا تحقیقات درمانی همچون سلول درمانی و پزشکی بازساختی که با همکاری بین زیست شناسان و پزشکان انجام می شود را در بر می گیرد. از طرفی اخیرا، اهمیت مطالعات کشت سلول و بافت به عنوان یک ابزار کلیدی در توسعه صنعت و بسیاری از علوم مهندسی نشان داده شده است و همچنین امکان انجام مطالعات بین رشته ای با هدف کاربردی شدن هر چه بیشتر دستاوردهای تحقیقاتی نیز فراهم شده است.

یادگیری مهارت های کشت سلولی در حوزه رشته های زیر کاربرد دارد.شما می توانید برای آگاهی از این رشته ها و بازار کار و زمینه های شغلی هر کدام روی لینک مربوطه کلیک کنید:

 دکتری بیوتکنولوژی پزشکی 

 کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی پزشکی (زیست فناوری پزشکی) 

 کارشناسی ارشد بیوشیمی بالینی وزارت بهداشت 

 کارشناسی ارشد میکروبیولوژی 

 کارشناسی ارشد میکروب شناسی پزشکی 

 کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی 

 کارشناسی ارشد زیست شناسی سلولی و مولکولی 

 دکتری ژنتیک پزشکی